Western Blot là một kỹ thuật so sánh được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu mô xuất xắc dịch tinh chiết mô.

Bạn đang xem: Phương pháp western blot

Phương pháp này sử dụng điện di bên trên gel nhằm phân bóc các protein còn vui sướng bằng cấu tạo 3D hay protein đã thay đổi tính theo độ lâu năm của mạch polypeptide. Protein này tiếp nối sẽ được đưa lên màng (thường thực hiện là màng nitrocellulose hay màng PVDF), ngơi nghỉ đó chúng được lắp bằng các kháng thể sệt hiệu cùng với protein mục tiêu. Điện di trên gel sẽ tiến hành đưa vào hệ thống phân tích Western Blot nhằm giải quyết và xử lý các vấn đề của các phản ứng chéo giữa các kháng thể.

*

Nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html

1. Nguyên lý

Western Blot là chuyên môn lai thân protein cùng với protein (Kháng nguyên – kháng thể). Protein phòng nguyên được phát hiện qua phản nghịch ứng tạo ra màu hoặc phát huỳnh quang

2. Các bước thực hiện

Bước 1:Xử lý mẫu

Lấy chủng loại từ toàn thể mô hay môi trường thiên nhiên nuôi cấy tế bào. Đầu tiên, xử trí mô rắn bằng phương thức cơ học áp dụng máy nghiền, sử dụng máy đồng hóa hoặc siêu âm. đông đảo mẫu vi khuẩn hay mẫu mã lấy trừ trong môi trường xung quanh nuôi cấy cũng rất có thể là mối cung cấp protein xác minh được trong Western Blot. Thêm những loại chất tẩy rửa, muối cùng dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein

Bước 2:Điện di bên trên gel

Điện di bên trên gel nhằm phân bóc tách các protein trong mẫu. Sự phân tách bóc này của protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc kết hợp các nguyên tố trên.

Phương pháp năng lượng điện di thịnh hành nhất là điện di trên gel polyacrylamide cùng có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS – PAGE (điện di bên trên gel polyacrylamide cùng có bổ sung SDS) giữ những polypeptide nghỉ ngơi trạng thái thay đổi tính sau thời điểm chúng được xử lý với hóa học khử mạnh mẽ và mất đi kết cấu bậc 2, kết cấu bậc 3.

Các mẫu được nạp vào trong những giếng của bản gel. Thường còn lại một giếng cho chỉ thị (marker) hoặc thang chuẩn ladder, là một thành phầm thương mại có chứa láo lếu hợp những protein với khối lượng phân tử khẳng định được nhuộm để hoàn toàn có thể tạo ra band color và nhận thấy được. Khi điện cụ được thiết lập trên gel, protein ban đầu di đưa với vận tốc khác nhau nhờ vào vào cân nặng phân tử của chúng. Vận tốc khác biệt của các protein (sự khác biệt về độ di động điện di) sẽ tạo nên thành vạch không giống nhau trên mỗi giếng.

Bước 3:Chuyển protein gel lên màng lai

Để các protein rất có thể phát hiện được phòng thể thì protein đề xuất được gửi từ gel lên màng lai. Cách thức chính nhằm chuyển những protein được gọi là phương pháp thẩm tách bóc điện là thực hiện một cái điện nhằm kéo những protein tự gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein được gửi lên màng mà lại vẫn gia hạn sự sắp xếp như trên bạn dạng gel. Tác dụng là protein sẽ được phơi ra bên trên lớp mỏng mặt phẳng để triển khai xác định

Bước 4:Xử lý màng lai (Blocking)

Do chống thể và protein đích đầy đủ là protein, phải thường thực hiện công việc để phòng chặn links giữa màng và chống thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu. Việc ngăn chặn những liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào hỗn hợp protein loãng albumin ngày tiết tương trườn 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột không khủng trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong hỗn hợp loãng đang gắn với màng ở toàn bộ các vị trí nhưng protein đích chưa gắn vào. Cho nên vì thế khi kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn chỗ dính trên màng nước ngoài trừ những vị trí liên kết đặc hiệu cùng với protein đích. Điều này làm sút nhiễu cơ bạn dạng trong sản phẩm ở đầu cuối của Western Blot, cho công dụng rõ ràng và ngoại trừ hiện tượng kỳ lạ dương tính giả.

Bước 5:Quá trình lai cùng phát hiện địa điểm lai

Để phân phát hiện những protein chuyên biệt, màng được dò protein đon đả bằng phòng thể đã đổi khác có năng lực liên kết với enzyme thông báo, enzyme này lúc kết phù hợp với một cơ chất khớp ứng sẽ ảnh hưởng phản ứng dung nạp quang và tạo màu. Quy trình này ra mắt gồm 2 bước:

- Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Chống thể sơ cấp là 1 trong kháng thể sệt hiệu được tao ra khi mang đến vật công ty hay môi trường thiên nhiên nuôi cấy tế bào miễn kháng tiếp xúc với protein quan tâm.

- sau khi rửa màng để sa thải kháng thể sơ cấp cho chưa liên kết, màng thường xuyên gắn chống thể máy hai (kháng thể thiết bị cấp) tất cả gắn enzyme (thường thực hiện horseradish peroxidase). Thường xuyên ủ màng lai vào một các thành phần hỗn hợp phản ứng đặc hiệu cùng với enzyme. Đặt 1 tấm phim ngạy cảm cùng với tia X lên màng lai để phát hiện tại các điểm sáng phát ra bởi enzyme.

Có thể thực hiện nhiều phương thức để vạc hiện phòng thể lắp thêm cấp: sử dụng bức xạ mặt trời gần link với phòng thể gắn hóa học huỳnh quang, sử dụng lưu lại phóng xạ

3. Ứng dụng

- xác minh sự hoạt động của gel thông qua sự có mặt của protein trong mô.

- dấn dạng protein mục tiêu.

- Đánh giá tính chăm biệt của kháng thể.

- Phân tích bệnh dịch do vi khuẩn và virus khiến ra: demo nghiệm xác định HIV, viêm gan B.

- Năm 2002, đã ứng dụng thành công phương pháp Western Blot trong việc xác minh kháng nguyên giun đũa chó (Toxocara canis) trên thỏ (Olga Lucia Morales và ctv, 2002), xuất hiện thêm một hướng đi bắt đầu trong câu hỏi xét nghiệm chẩn đoán đúng đắn các căn bệnh ký sinh trùng bên trên người.

Xem thêm: Giải Thích Ý Nghĩa Câu Tục Ngữ Ăn Quả Nhớ Kẻ Trồng Cây, Giải Thích Ý Nghĩa Câu Ăn Quả Nhớ Kẻ Trồng Cây

Tài liệu tham khảo

Olga Lucia Morales, 2002. Identification of Toxocara canis antigen by Western Blot in experimentally infected rabbits.Rev. Inst. Med.trop. S. Paulo44 (4):213 – 216. Http://biology.vn/phuong-phap-western-blot/